実験の流れ

ステップ			使用する製品
		１．サンプル調製 細胞や組織などからRIPAやSDSサンプルバッファーでタンパク質を抽出し、SDS処理および還元処理を行います。	タンパク質抽出・サンプル調製液  EzSubcell series, EzApply ブロックインキュベータ  MyMini Block
		２．ゲルの作製 目的タンパク質の分離に適したアクリルアミドの濃度のゲルを作製します。既製ゲルを使用すると、より迅速に、精度・再現性の高い実験を行うことができます。	ゲルバッファー  EzGel Ace, EzGel Sep, EzGel Stack ゲル作製器 多連ミニゲル作製器
		３．電気泳動 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離します。目的タンパク質により、アクリルアミドの濃度を変えます。	ゲル・電極バッファー  ePAGEL HR, EzRun 電気泳動槽・パワーサプライ  Pagerun-Ace, MyPower
		４．ゲルの染色 泳動後のゲルをCBB染色、もしくは銀染色します。あるいはウェスタンブロッティング等の様々な実験に適した処理を行います。	ゲル染色液  EzStain AQua/Silver/Reverse シェーカー  SeesawShaker atto

機器・試薬・材料

●　細胞・組織サンプル等（例：Hela細胞）
●　EzApply/EzLabel FluoroNeo・・・タンパク質抽出・処理液
●　e-Pagel HR ・・・プレキャストゲル
●　EzRun/EzRun MOPS ・・・電極バッファー
●　MyMini BLOCK・・・ヒートブロックインキュベータ
●　Rapidus Mini/PageRun-Ace/Compact PAGE Ace・・・電気泳動槽
●　MyPower・・・パワーサプライ
●　EzStain AQua/Silver/Reverse・・・ゲル染色液
●　トレイ（ゲルサイズより一回り大きいもの）
●　SeesawShaker atto・・・シーソーシェーカー

《自作ゲルを作製する場合》
●　EzGel Ace/EzGel Stack/EzGel Sep・・・ゲルバッファー
●　アクリルアミド/ビス混合液・・・アクリルアミドモノマー
●　APS (過硫酸アンモニウム）・・・重合開始剤
●　TEMED（N,N,N',N',-テトラメチルエチレンジアミン）・・・重合促進剤
●　蒸留水
●　ゲル作製器/多連ゲル作製器
●　ゲルプレート
●　コウム
●　スペーサー

実験方法

サンプル調製　ゲルの作製　電気泳動　ゲル染色

サンプル調製

《通常の電気泳動サンプル》
① 50μLのサンプルに50μLのEzApply （2×濃度、キット添付DTT溶解済み）を加えて混合します。

② MyMini BLOCKで95℃5分間加熱します（煮沸でもOK）。

③ 15,000rpmで5分間遠心し（しなくてもOK）上清を回収します。
※作製したサンプルは-20℃で保存可能です。
※EzApplyの代わりにSDS Gel Loading Buffer (5x濃度)を使用することも可能です。

 
《蛍光ラベル電気泳動サンプル》
① EzLabel FluoroNeoを使用します。40 μLのタンパク質サンプルにキット添付の10 μLのSample buffer (5x conc.) とLabeling reagent を0.5 μL添加して混合します。

② MyMiniBlockで95℃3分間加熱します（煮沸でもOK）。

③ ②の混合液にReducing agent (DTT)を2μL 添加して混合します。

④ MyMiniBlockで95℃3分間加熱します（煮沸でもOK）。
※作製したサンプルは-20℃で遮光保存可能です。

参考：「組織・細胞からのタンパク質抽出方法」「電気泳動用の試料調製」もご覧ください。

ゲルの作製

① 自作ゲルを作製する場合は下記（A）～（D）の試薬が必要です。
(A) アクリルアミド/ビス溶液
アクリルアミド/ビス混合溶液は分画分子量範囲に応じて、一般的に19:1、29:1、37.5:1の架橋率の溶液が使用されます。架橋率が高い溶液ほど低分子量側の、また架橋率が低いほど高分子量側の分画範囲が広がります。目的分画範囲に応じて下記の例を参考に選択・ご準備ください。

《30(w/v)% アクリルアミド/ビス(29:1)溶液》
29 gのアクリルアミドと 1 gのN,N'-メチレンビス(アクリルアミド) を秤量し、50 mLの蒸留水に溶解します。溶解後、蒸留水で100 ｍLにメスアップします。
※アクリルアミドのモノマーには神経毒性があります。取扱う場合には手袋など身体の保護を行ってください。
※アクリルアミド/ビス溶液は30(w/v)% アクリルアミド/ビス(29:1)溶液 や30(w/v)% アクリルアミド/ビス(37.5:1)溶液などが市販されています。架橋率が高い（ビスの割合が多い）と、架橋構造が増えて格子構造が密になった硬いゲルができ、より低分子量領域の分画が明瞭になります。

(B) ゲル緩衝液
《EzGel Ace》　中性のゲル緩衝液であり、濃縮および分離ゲルに使用できます。作製したゲルは長期冷蔵保存可能（約１か月）です。
《EzGel Stack》　Laemmli法に準拠した濃縮ゲル用緩衝液です。0.5 M Tris-HCl (pH6.8)相当のバッファーです。
《EzGel Sep》Laemmli法に準拠した分離ゲル用緩衝液です。1.5 M Tris-HCl (pH8.8)相当のバッファーです。
※ゲル緩衝液にはEzGel Ace単独、もしくはEzGel StackとEzGel Sepの組み合わせでご使用ください。

(C) 10% APS （過硫酸アンモニウム）
0.1 gのAPSを秤量し、1 mLの蒸留水に溶解します。
※10％ APSは徐々に活性が落ちるため、要時調整することをお勧めします。冷蔵庫で1週間位保存可能です。

(D) TEMED（N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン）
原液をそのまま使用します。

　参考：「ポリアクリルアミドゲルの調製」もご覧ください。

動画で紹介

　　　　　　
主な電気泳動用試薬の組成

電気泳動で使用する主な試薬の組成です。より再現性良く、簡便に実験を行う際はパジェルなどの既製ゲルやアトー試薬をご利用ください。

・サンプルバッファー（5x)：250mM Tris-HCl (pH6.8)、8% SDS、0.1% Bromophenol blue、40% Glycerol、100 mM DTT
・濃縮ゲル緩衝液：0.5 M Tris-HCl (pH6.8)
・分離ゲル緩衝液：0.5 M Tris-HCl (pH6.8)
・アクリルアミドストック溶液：30％Acrylamide/N,N'-methylene-bis acrylamide (29:1)
・泳動用緩衝液：25mM Tris, 192mM Glycine, 0.1% SDS
・CBB染色液：0.25% Coomassie Brilliant Blue, 40%メタノール, 7% 酢酸
・脱色液：40% メタノール、7％酢酸

　
② ゲル溶液を調製します。ゲル組成表（下表）に従い、分離ゲルと濃縮ゲルのゲル溶液を作製します。
※APSとTEMED以外の溶液を混合します。
※下表は１枚のミニサイズゲルに必要な容量です。

➂ 分離ゲル溶液にAPSとTEMEDを添加し、泡立てないように混合し、ゲルプレートに分離ゲル溶液を流し込みます。
※泳動槽およびゲル作製器の使用方法は各製造メーカーにお問い合わせください。

④ 界面を乱さないように気をつけながら、蒸留水を重層します（0.2～1.0 mL）。
※アクリルアミドは酸素があると重合しにくいため、蒸留水を重層することで空気中の酸素を遮断します。

⑤ 室温で30分以上静置して重合します。
※ゲルの界面が明瞭に見えることを確認してください。重合時間は季節や室温によって変わります。20℃以下では重合しにくくなるので、ご注意ください。

⑥ 重層した蒸留水をペーパータオルなどに吸わせて完全に除きます。

⑦ 濃縮ゲル溶液にAPSとTEMEDを添加して泡立てないように混合し、分離ゲルの上に濃縮ゲルを重層します。

⑧ コウムを差し込み、室温で30分以上静置して重合します。
※EzGelAceを使用して作製したゲルは、ラップ等で包み、蒸留水で4倍希釈したEzGelAceを約5mL（ゲル一枚当たり）入れたハイブリバック等に密閉して冷蔵庫で約一か月保存可能です。Laemmli法のゲルバッファーで作製したゲルは保存できませんので、即日ご使用ください。

電気泳動

① 泳動層の下部槽に十分量の電極液を入れます。
※電極液が不足すると泳動パターンが乱れる原因になります。

② 自作ゲルもしくは既製ゲル（e-PAGEL HR）をPageRun-Ace（電源付電気泳動装置）に、ゲル下端に空気が入らないように注意しながらセットします。

➂ 上部槽に十分量の電極液を入れます。

④ １レーンあたり5～10μLのサンプルをアプライします。
※サンプル濃度は精製タンパク質では100ng～1μg/lane、抽出液では1～50μg/laneが適当です。

⑤ スタートボタンを押して電気泳動を開始します。
※High mode　(24W)で35分、もしくはStandard mode (20mA/gel)で約80分間泳動します。

動画で紹介

ゲル染色　

① ミニゲル1枚当たり30～50mL のEzStain AQuaをゲルよりもひと回り大きなタッパーに注ぎます。

② 電気泳動直後のゲルをEzStain AQuaに浸漬し、室温で3時間～一晩振とうしながら染色します。
※高濃度のタンパク質染色には長時間を必要とします。
※電子レンジを使用すると迅速に染色できます。

➂ タンパク質バンドが十分染色できたのを確認した後、EzStain AQuaを廃棄し、蒸留水でゲルを軽くすすぎ、新たに十分量の蒸留水を加えて脱色します。途中、何度か蒸留水を交換し、バックグラウンドが透明になるまで脱色します。
※色素廃液として適切な処理をお願い致します。
※電子レンジを使用すると迅速に脱色ができます。
※ 自作のCBB染色液（前述）を使用する際は、染色は６時間以上、脱色は専用の脱色液（前述）で4～6時間以上行ってください。また自作のCBB染色液はEzStain AQUAよりも検出感度が低いため、サンプル量にご注意ください。

参考：銀染色、リバース染色については、「電気泳動ゲルのタンパク質の染色」もご覧ください。

参考データ

実験例１：染色方法の違い

上図はトランスフェリンタンパク質をEzApplyもしくはEzLabel FluoroNeoを使用して電気泳動サンプルを作製した後に、レーン当たり400ngからの1/2希釈系列で泳動した結果です。電気泳動後のゲルはEzStain AQua、自作CBB染色液、およびEzStain Silverで染色しました。EzLabel FluoroNeoサンプルは泳動後のゲルをCyanoView (Cyan透過光源）で励起し、540 nm LPフィルターを用いて0.5秒間の露光時間でLuminoGraphにより撮影した結果です。自作CBB染色液よりもEzStainAQuaは検出感度が高く、またEzLabel FluoroNeoは銀染色と同等以上の検出感度を示しました。EzLabel FluoroNeoは染色時間が不要であり、撮影後のゲルはウェスタンブロット等の解析にも使用できるため、短時間で効率よく実験を行うのに適しています。一方、染色後のゲルはウェスタンブロット等への解析には適しません。染色方法は実験目的や検出感度に合わせてを選択してください。

実験例２：泳動バッファーの違い

上図は様々なタンパク質を同じアクリルアミド濃度の10％ ePagel-HRを使用し、泳動バッファーが異なる条件、EzRun （左）とEzRun MOPS（右）で電気泳動した結果です。四角で囲った部分は、両方とも分子量マーカーであるEzProtelin Ladderを泳動したレーンですが、EzRunでは10本のバンドが検出されたのに対して、EzRun MOPSでは13本のバンドが検出されており、低分子量側のタンパク質も分離できることが示されました。つまり泳動バッファーをEzRun MOPSに変えるだけで、10％の濃度均一ゲルが、まるで濃度勾配ゲルのようなバンドパターンを示すようになりました。このように泳動バッファーを変えることで、同じアクリルアミド濃度のゲルを使用しても、タンパク質の分離範囲を変えることができます。

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