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ELISAの基本操作 ~原理~

ウィルスに感染したかどうか?ワクチン接種で抗体ができたかどうか?など、ある分子(この場合、ウィルスもしくは抗体)が、サンプル中(この場合、検体や血清など)に有るか無いか?どれくらい含まれているのか?を調べる方法として、抗体を利用した免疫学的手法があげられます。もちろんPCR 検査もありますが、抗体のように根本的には同じ構造なのに多様性に富んでいる場合、ある特定の抗体だけをPCR で検出することは困難です。ELISA はウェスタンブロッティングのような手間もなく、多検体から特定の分子を検出し、定量する上で有効な手法として使用され続けています。
ELISA(エライザ/ イライザ)という耳慣れない単語は、Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay の頭文字をとったもので、EIA 法(EnzymeImmunoassay)、酵素免疫測定法とも呼ばれています。血液や尿、細胞抽出液などの、様々なタンパク質が雑多に含まれる溶液サンプル中に、ある特定のターゲット分子(タンパク質、ホルモン、ペプチドなど)がどれだけ含まれているかを、抗体を利用して検出します。一般的に、検出には西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP: Horseradish Peroxidase) やアルカリフォスファターゼ(ALP: Alkaline phosphatase) などの酵素標識抗体を使用するため、「Enzyme(酵素)」という単語が入っています。酵素標識抗体の酵素と基質との酵素反応の結果、定量的に生じる発色や発光を測定します。酵素活性の発色検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定によって、ターゲット分子の量を数値化します。酵素反応により蛍光や発光を生じる基質を用いた場合は、ルミノメーター/フルオロメーター等で発光量/蛍光量を測定します。酵素を使
用せずに、放射性同位体(RIA: Radio Immunoassay)、化学発光化合物(CLIA: Chemiluminescent Immunoassay)や蛍光色素(FIA: Fluorescent Immunoassay) を使用した方法もあります。

ELISA法の種類

ELISA 法は、固相(プレート)にコートする抗体(あるいは抗原)と検出する標識抗体(あるいは標識抗原)の組合せや、反応方法によって、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法などがあります。いずれも酵素活性からターゲットの量を算出します。

 

直接法 Direct ELISA

マイクロプレートに測定サンプル(抗原)をコートし、ターゲット対する酵素標識抗体と反応させ、ターゲットと結合した標識抗体の酵素活性を測定します。抗体をコートして標識サンプルで検出する場合もあります。

 

間接法 Indirect ELISA

マイクロプレートに測定サンプル(抗原)をコートして、ターゲット対する抗体(一次抗体)と反応させ、さらに、一次抗体に対する酵素標識された二次抗体と反応させて、間接的にターゲットと結合した抗体量を測定します。一次抗体を直接標識して検出せずに、酵素標識二次抗体や酵素標識アビジン―ビオチン反応等を介して間接的に検出する方法をいいます。直接法に比べて間接法は反応ステップが多くなりますが、市販の酵素標識二次抗体が使用可能で、感度も高くなります。

 

サンドイッチ法 Sandwitch ELISA

マイクロプレートにターゲットに対する抗体(固相用)をコートし、測定サンプル(抗原)と反応させます。続いてターゲットに対する別の酵素標識抗体(検出用)と反応させて、ターゲットと結合した抗体の酵素活性を測定します。検出用に未標識抗体を使用した場合は、この抗体に対する酵素標識二次抗体を使用します。また検出用にビオチン化抗体を使用した場合は、酵素標識アビジンとの反応を介して検出します。固相化した抗体(紺)と検出用の抗体(ピンク)のエピトープ(抗原認識部位)は異なります。

 

競合法 Competitive ELISA

マイクロプレートにターゲット(抗原)に対する抗体をコートし、測定サンプルと一定量の標識抗原を競合的に結合させ、コートした抗体に結合した標識抗原の量を検出し、サンプル中に含まれるターゲットの量を測定する方法です。変法として、逆に抗原(ターゲット)をコートし、測定サンプルと標識抗体(ターゲットに対する)を添加して競合的に結合させ、残った標識抗体(コートした抗原に結合)の量を検出する方法もあります。いずれもサンプル中に含まれる抗原が多い場合は、抗体と結合できる酵素標識抗原(もしくは抗原と結合できる酵素標識抗体)が減少し、発色が弱くなります。

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