検出方法の選択

ターゲットタンパク質の検出感度や測定範囲に応じて、検出用抗体（抗原）の標識物質と基質を選択します。よく使用される代表的なものとしては西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（ALP)が挙げられます。その他、ルシフェラーゼ、ガラクトシダーゼ、アクリジニウム誘導体等があります。またDABやNBT/BCIPのような非水溶性の基質は避けます。

固相（プレート）の選択

抗体（抗原）をコートする固相の種類としてはマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズなどがあります。ELISAでは多検体の測定に便利で、高感度なマイクロプレートが使用されます。ビーズは表面積を増大させ、反応の迅速化が可能になります。ELISA用の固相は抗原や抗体などの吸着性が変わるような表面処理が加工されています。測定するターゲットにより適した表面処理が異なりますので、実際に使用した上で、検出感度や精度など、目標に合わせた固相を選択する必要があります。
また測定装置や発色（吸光）、発光、蛍光のいずれの方法で検出するかによって、適した色のELISA用プレートを選択します。一般的に発色検出には透明プレートを、発光検出には反射が最大限に、自己発光が最小限となる白色プレートを、蛍光検出には蛍光測定時のバックグラウンドを最小限に抑える黒色プレートを使用します。いずれもELISA用に表面加工されたプレートを使用します。

コート方法の選択

プレート（固相表面）に抗体（抗原）をコート（不溶化）する方法には共有結合によるものと物理的吸着の2つがあります。共有結合によるコートには特殊加工された表面をもつプレートが使用されます。物理的吸着によるコート方法の方がより一般的ですが、コートするタンパク質の溶媒のpHは高い方が吸着量が多いと言われています。コートするタンパク質の可溶化に、特殊な溶剤や高濃度の界面活性剤が含まれている場合は、物理的吸着を妨げる可能性がありますので、共有結合によるコート方法を選択します。

ブロッキング剤の選択

抗体（抗原）によってプレートをコートした後も、まだコートされていない表面が残っているため、この部分を他の物質で覆って非特異的吸着を最小限におさえます。この操作をブロッキングといいますが、バックグラウンドを下げ、S/N比を向上させる上で重要です。ブロッキングには、抗原抗体反応に重要なエピトープを変性または阻害せず、ターゲットとは無関係なタンパク質や化合物の溶液を用います。代表的なブロッキング剤としては、アルブミン、カゼイン、スキムミルク、血清、ゼラチン、化合物などがあります。

アトーのブロッキング試薬

コート（キャプチャー）用抗体

ELISAで測定するサンプルは、ウェスタンブロッティングなどとは異なり、SDSや還元剤などによる変性/加熱処理や、電気泳動による分離をしないため、サンプル中のタンパク質の立体構造が、比較的、保たれた状態で存在していると考えられます。そのため抗体が認識するエピトープ部位が、ターゲットタンパク質（コンプレックス含め）の立体構造表面に露出していないと結合できません。また、血清など補体が含まれているサンプルの場合、補体と抗体が非特異的に結合し、バックグラウンドが上昇する原因になることがあります。そのような場合は抗体が消化された、Fc領域のないFabやF(ab')2を使用します。さらに抗体以外の添加剤（保護剤など）により、固相効率に影響が出る場合もあるので注意します。抗体を購入する際は適用用途を必ず確認し、「ELISA」用や「IP（免疫沈降）」用など非変性条件下でも結合する可能性の高いものを選択します。

検出用抗体

検出用抗体は、コート用抗体と同様に表面抗原に対する抗体であり、且つ、酵素（蛍光）標識されている抗体を選択します。ターゲットタンパク質に対する標識抗体がない場合は、酵素標識2次抗体を使用して間接法により検出するか、もしくは市販のラベリングキットなどを使用して検出用抗体を酵素標識します。また2次抗体は免疫動物などに注意して、交差反応が生じにくいものを選択します。

免疫動物と抗体の組み合わせ

抗体を作製するために使用した動物を免疫動物といいます。特に、2次抗体を使用して間接法により検出する際は、検出用抗体を作製した免疫動物の抗体を認識する2次抗体を使用します。ただし、コート用抗体と検出用抗体が同じ免疫動物種だった場合、2次抗体がコート用抗体にも結合してバックグラウンドが上昇する原因になります。また異なる免疫動物種由来の抗体を使用していても、2次抗体の交差反応により、非特異的にコート用抗体と検出用抗体に結合する場合があります。2次抗体は、交差反応が生じないように目的の動物種以外の抗体には反応しないように、免疫吸収されたものを使用します。異なる免疫動物種でペア抗体が見つからなかった場合には、検出用抗体をビオチン化し、酵素標識ストレプトアビジンで検出する方法もあります。