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ウェスタンブロッティングのコツ
ウエスタンブロッティングの基本操作

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1.概要

ウェスタンブロッティングはタンパク質サンプル中に含まれる特定のタンパク質の発現量を確かめるために使われる一般的な手法です。実験操作は簡単ですが、なかなか思うようなデータを取ることができないといった経験を持つ方は多いのではないでしょうか。今回はアトーの製品を使用したウェスタンブロッティングの基本操作に関してご紹介します。

     

2.実験の流れ

Note_WB_basic_fig1
実験ステップ  使用する製品
細胞や組織などからRIPA Lysisバッファー やSDSサンプルバッファーでタンパク質を抽出し、SDS処理および還元処理を行います。

タンパク質抽出・処理液

EzRIPA Lysis kitEzApply, EzLabel FluoroNeoなど

ブロックインキュベータ

MyMiniBLOCKPowerBLOCKなど

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によりタンパク質を分離します。目的タンパク質により、アクリルアミドの濃度を変えます。

ゲル・電極液

ePAGEL HR, EzRunEzRun MOPSなど

電気泳動槽・パワーサプライ

PageRunAcePowerStation Ghibli IMyPower IIなど

電気泳動で分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に転写します。

トランスファーバッファー

EzFastBlot HMWEzFastBlotなど

ブロッター・パワーサプライ

PoweredBLOT 2Mなど

タンパク質バンドがない膜表面に、抗体が非特異的に結合しないようにブロッキングします。

ブロッキング剤

EzBlockChemiなど

シェーカー

SeesawShaker atto

ターゲットタンパク質に対する抗体(一次抗体)および酵素で標識された抗体(二次抗体)と反応します。

抗体・洗浄液

EzTBS, EzTween,,,

シェーカー

SeesawShaker atto

二次抗体に標識された酵素を発色基質あるいは発光基質と反応して、ターゲットタンパク質のバンドを間接的に検出します。

発光・発色基質

EzWestLumiOne, EzWestBlueなど

化学発光撮影装置

Luminograph I/II/III

膜に結合した抗体を剥離して、同じブロッティング膜から別のターゲットタンパク質を検出します。

ストリッピング剤

EzReprobe

シェーカー

SeesawShaker atto

     

3.実験方法

機器・試薬・材料

● 細胞・組織サンプル等(例:Hela細胞)
EzRIPA Lysis kitEzApplyEzLabel FluoroNeo・・・タンパク質抽出・処理液
ePAGEL HR ・・・プレキャストゲル
● EzRunEzRun MOPS ・・・電極液
WSE-4050~4053クリアブロット・Pプラス膜シリーズ・・・PVDF膜
CB-06A,09A,13A,20Aアブソーベントペーパーシリーズ・・・ろ紙
EzTBS・・・洗浄液(Tris buffer saline)
EzTween・・・洗浄液に添加する界面活性剤
EzFastBlot HMWEzFastBlot・・・トランスファーバッファー
EzBlockChemi・・・ブロッキング剤
EzWestLumi plus・・・HRP発光基質
MyMiniBLOCKPowerBLOCK・・・ヒートブロックインキュベータ
Rapidus Mini slabPageRunAce・・・電気泳動槽
PowerStation Ghibli IMyPower II・・・パワーサプライ
PoweredBLOT 2M・・・セミドライブロッター
Luminograph I/II/III・・・発光撮影装置
● 一次抗体(例:抗ヒトトランスフェリン-ウサギ抗体)
● HRP標識2次抗体(例:HRP標識抗ウサギIg抗体)
● ピンセット、トレイ(ゲルサイズより一回り大きいもの)
SeesawShaker atto・・・シーソーシェーカー

3-1.サンプル調整

①50μLのサンプルに50μLのEzApply (2×濃度、DTT添加済み)を加えて混合します。
②MyMiniBlockで95℃5分間加熱します(煮沸でもOK)。
③15,000rpmで5分間遠心し(しなくてもOK)上清を回収します。

3-2.電気泳動

①e-PAGEL-HR(プレキャストゲル)をPagerun Ace(電源付電気泳動装置)にセットします。
②1レーンあたり5~10μLのサンプルをアプライします。
※サンプル濃度は精製タンパク質では100ng~1μg/lane、抽出液では1~50μg/laneが適当です。
③スタートボタンを押して電気泳動を開始します。
※High mode (24W)で35分、もしくはStandard mode (20mA/gel)で約80分間泳動します。

3-3.トランスファー

①あらかじめP plus膜をメタノールで浸水化処理し(5秒)、EzFastBlotに浸漬しておきます(15分以上振とうします)。
②電気泳動後のゲルをEzFastBlotで洗浄し、下図のように陽極側(下)からろ紙2枚、P plus膜、ゲル、ろ紙2枚の順に重ねます。ろ紙は重ねる直前にEzFastBlotに浸漬します。
※空気を専用ローラーを使って押し出し、ろ紙、膜、ゲルを密着します。
③スタートボタンを押してトランスファーを開始します。
※Rapid mode (20~25V/gel)で10~15分通電します。

 

Note_WB_Basic_Fig2

  

ブロッターのセッティング方法の操作説明動画も、せひご覧ください!

  
 アトーのブロッティング溶液
製品名 EzBlot EzFastBlot EzFastBlot HMW

EzRun TG

(Towbin法)

Cat# AE-1460 AE-1465 WSE-7210 WSE-7055
主成分

3液法(不連続)

A: トリス
B: トリス
C: トリス、6-アミノカプロン酸
A~C: +MeOH (5%)

1液法(連続)

トリス
アミノ酸
MeOH不含

1液法(連続)

トリス
MeOH不含

1液法(連続)

25mM トリス、192mMグリシン, ~10% MeOH(終濃度)

転写可能分子 ~300kDa ~200kDa ~600kDa ~200kDa
転写条件 2 mA/cm2
60 min
20~25V c.v.
5~15 min
25V c.v.
15~30 min
2 mA/cm2
60 min
使用方法 MeOHを添加する 蒸留水で10倍希釈 蒸留水で5倍希釈 蒸留水で10倍希釈
特徴 広範囲の分子量をシャープなバンドでキレイにトランスファー 約10分で200 kDa 以下の分子を高効率にトランスファー 30分以内に200 kDaの高分子も効率よくトランスファー セミドライ式では低効率だが、タンク式でも使用可

※メタノールは膜へのタンパク質結合効率を上げられます。PVDF膜≦15%、ニトロセルロース膜≦20%で使用します。
※高分子タンパク質の場合、0.01~0.1%SDSを添加すると転写効率が上がる場合があります。
※トランスファー前に泳動後のゲルをトランスファーバッファーで15~30分間平衡化すると転写効率が上がる場合があります。ただしバンドが拡散したり、低分子バンドが消失する場合がありますのでご注意ください。
※トランスファーパック「QBlot kit」はろ紙や膜の準備が不要です(Ready to use)。専用ブロッティングバッファーにより転写効率も高く、短時間で高効率のウエスタンブロッティングが可能です。   

 3-4.ブロッキング

トランスファー後のP plus膜をブロッキング剤に浸漬し、室温で30分振とうします。ミニゲル1枚当たり50mL準備します。

アトーのブロッキング溶液
ブロッキング剤 スキムミルク EzBlock Chemi EzBlock BSA EzBlock CAS
Cat# AE-1475 AE-1476 AE-1477
主成分 牛スキムミルク 合成ポリマー 牛アルブミン 牛カゼイン
反応時間 30-60min 5-60min 15-60min 15-60min
アビジンービオチン NG OK OK NG
リン酸化タンパク質 NG OK OK NG

※スキムミルクは3%前後の濃度でTBS-Tに混合して使用します。
※EzReprobeを使用する場合はEzBlockCASの使用を推奨します。

3-5.抗体反応

①一次抗体を0.1% Tween含有のEzTBS(TBS-T)もしくはEzPBSで希釈します(10mL/gel)。
※抗体の希釈率は抗体によって異なります。各抗体に添付された取扱説明書をご参考ください。一般的には数百~数千倍希釈です。
② P plus膜よりも一回り大きい容器に①の抗体溶液を入れ、室温で1時間振とうしながらP plus膜と反応します。
※抗体の反応時間と温度は抗体によって異なります。各抗体に添付された取扱説明書をご参考ください。一般的には室温および37度で30分~1時間、もしくは4℃で一晩反応します。
③抗体を捨てて0.1% Tween含有EzTBS(TBS-T)を50mL 添加し、5分間振とうします(洗浄操作)。洗浄操作は3回以上繰り返して行います。
④HRP標識二次抗体を0.1% Tween含有のEzTBS(TBS-T)もしくはEzPBSで希釈します(10mL/gel)。
※抗体の希釈率は抗体によって異なります。各抗体に添付された取扱説明書をご参考ください。一般的には数千~数万倍希釈です。
※バックグランドが高い場合は抗体の希釈率を上げる、もしくは抗体希釈溶液にブロッキング剤を通常の1/10量添加すると軽減されます。
⑤洗浄後のP plus膜に④の抗体を添加し、室温で30分間振とうしながら反応します。
※抗体の反応時間と温度は抗体によって異なります。各抗体に添付された取扱説明書をご参考ください。一般的には室温で30分~1時間、もしくは4℃で一晩反応します。
⑥抗体を捨てて0.1% Tween含有EzTBS(TBS-T)を50mL 添加し、5分間振とうします(洗浄操作)。洗浄操作は3回以上繰り返して行います。
※洗浄しすぎるとシグナルが弱くなる場合があります。

3-6.検出   

① 検出方法および目的の検出感度に合わせてHRP検出試薬を選択します(下表参照)。
② PVDF膜をHRP検出試薬に浸漬して反応します。

HRP検出試薬 EzWestBlue EzWestLumiOne EzWestLumi plus
Cat# AE-1490 WSE-7110 WSE-7120
検出方法 TMBによる呈色 Luminolによる発光 Luminolによる発光
使用方法 PVDF膜を溶液に浸漬して10~30分 PVDF膜を溶液に浸漬してすぐに検出 使用直前にA液とB液を等量混合する
検出感度 pg pg低域 fg中域
発光持続時間 - 1時間< 3時間<

※EzWestBlueを使用する場合、PVDF膜と10~30分間、遮光しながら反応し、スキャナー等でスキャンしてデータを記録します。
※EzWestLumiOneはPVDF膜を浸漬した後、すぐに発光撮影装置で撮影し、データを取得してください。
※EzWestLumi plusはReagent AとReagent B を1:1の等量で混合し、PVDF膜を浸漬した後、すぐに発光撮影装置で撮影し、データを取得してください。
※検出試薬の使用量は100~200μL/cm2 です。ミニゲルサイズの場合、5mL以上準備してください。 

3-7.ストリッピング

① 検出反応後のブロッティング膜は、0.1% Tween含有EzTBS(TBS-T)でリンスした後、ストリッピングを行うまでTBS-T中で冷蔵保存してください。
② 100mLのEzReprobeに対して、0.6gのEnhancerを添加して溶解します。
③ ブロッティング膜をEzReprobeに浸漬し、室温で5~15分間振とうします。
※抗原量が多い場合や抗体のタイターが高い場合には反応時間の延長する、もしくは反応温度を上げるとストリッピング効率が向上します。
④ EzReprobeを廃液し、EzTBS(Tween 20含有)等の洗浄液を数mL加えて容器の内壁を軽くすすぎます。
⑤ 約30mLのTween 20 含有EzTBSを注ぎ 3分間振とうします。
⑥ ブロッティング膜をEzBlock CAS等のブロッキング溶液でブロッキングします。
⑦ 新たな一次抗体、二次抗体を順次反応させます。

    

参考データ

実験例 EzReprobe とブロッキング試薬
Note_WB_Basic_Fig3

左図の実験はEzReprobeとブロッキング剤の影響を検討した結果を示しています。まずHela細胞からEzRIPA Lysis kitにより抽出した細胞抽出液をEzApplyと混合し、MyMiniBlockを用いて95度で10分間反応して泳動サンプルとしました。サンプルを段階希釈して10%ePAGELゲルで泳動分離し、EzFastBlotでP plus膜に20V定電圧で10分間転写しました。その後、EzBlockChemiで30分間ブロッキングし、抗SMADラビットモノクローナル抗体と反応して、EzWestLumi plusでシグナルを検出しました。発光イメージをLuminographで撮影後、EzReprobeと室温で10分間反応してストリッピングし、図示した各ブロッキング剤で15分間ブロッキングしました。抗GAPDHラビットポリクローナル抗体で反応した後、EzWestLumi plusでシグナルを検出し、Luminographで撮影しました。左図の結果のように、EzReprobeでストリッピングした後はEzBlockCASでブロッキングすると、バックグランドが低く抑えられ、非特異的なバンドが検出されず、きれいなデータが得られることが示されました。

    

関連製品

WSE-4055 QBlot kit

親水化・平衡化済みのPVDF膜とパットがセットになったセミドライブロッティング用のトランスファーパックです。1回分のパックの封を切り電気泳動後のゲルを乗せればすぐにブロッティングが可能です。最短5~10分の転写ができます。各種セミドライブロッティング装置に対応します。   

キット内容 Top/Bottom Stack:90×85mm 各10パックGel Wash Buffer(5×):100mL
分子量範囲 ~250kDa
保存期間 1年間(冷蔵)
容量 10回分/箱
価格 16,800円

       

簡単!きれい!速い! QBlot kitの操作説明動画もぜびご覧ください!

  

     

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