Home Technical Info ウェスタンブロッティングのコツ セミドライブロッティング試薬の選び方

セミドライブロッティング試薬の選び方

アトーでは、目的に合わせたさまざまなセミドライブロッティング試薬をそろえました。

今回は、特長別に製品をご紹介します。

  

    トランスファーパック セミドライブロッティング試薬     タンク式ブロッティング試薬
型式 WSE-4055  WSE-7210 AE-1465 AE-1460  WSE-7055
名称 QBlot kit EzFastBlot HMW EzFastBlot EzBlot EzRun TG
操作性 ★★★★★ ★★★☆☆ ★★★☆☆ ★★☆☆☆ ★★☆☆☆
転写時間 ★★★★★ ★★☆☆☆ ★★★★★ ★★☆☆☆ ★☆☆☆☆
転写効率 ★★★★★ ★★★★★ ★★★★★ ★★★★★ ★★★★★
高分子タンパク質 ★★★★☆ ★★★★★ ★★☆☆☆ ★★★☆☆ ★★★★★
分子量範囲 ~250kDa ~600kDa 低分子~200kDa ペプチド~250kDa 低分子~200kDa
最短転写時間

5分

(24V)

30分

(25V)

10分

(6mA/cm2 or 25V)

30分

(2mA/cm2)

60分

(高電圧)

 

セミドライブロッティングについて

簡単!トランスファーパック

高分子高速転写バッファー

高速転写バッファー

3液系の高効率な転写バッファー

セミドライブロッティングについて

ブロッティング装置模式図

 

ウエスタンブロッティングは、電気泳動で分離したゲル中のたんぱく質を、膜に移して検出する実験方法です。ウエスタンブロッティングには、大きく分けて『セミドライ式』と『ウェット式(タンク式)』の2種類の方法があります。

セミドライ式ブロッティングとは、平らな電極板の間に、ブロッティング溶液を含ませたろ紙、膜(メンブレン)、電気泳動後のゲルを積層して密着させ、電気を流してゲル中の試料を膜上に移行させる手法です。

セミドライ式ブロッティングは、ブロッティング溶液をろ紙に含ませるだけなので、タンク式に比べて少量の溶液量で行うことができます。また過電流や発熱の心配も少ないので、冷却装置などが必要ありません。

アトーではこのような特長を基に、セミドライ式を推奨しています。

 

  

 

参考データ

転写バッファーによる違い

様々なアトー製トランスファーバッファーを用いてブロッティングを行った後のブロッティング膜とゲルをEzStain AQua (CBB) で染色した結果です。EzRunTG(従来のTowbin 法によるトランスファーバッファー)よりもEzBlot、EzFastBlot、EzFastBlot HMW はセミドライ式でも高効率にタンパク質バンドをトランスファーできます。EzFastBlot は約10 分の短時間で~ 200kDa までのタンパク質をトランスファーするのに適しており、EzFastBlot HMW は200kDa 以上の高分子タンパク質も約30 分間という短時間で、タンク式のブロッティングと同等以上の効率でトランスファーできます。またEzBlot はタンパク質をシャープなバンドで明瞭にトランスファーするのに適しています。

  

 

セミドライブロッティングの基本操作

実験ステップ  
セミドライブロティング基本操作①

 

 

 

 

ブロッターの下部電極板にブロッティング溶液を染み込ませたろ紙をセットします。

セミドライブロティング基本操作②

 

 

 

ろ紙の上に親水化・平衡化済みのPVDF膜をセットします。

セミドライブロティング基本操作③

  

 

 

 

PVDF膜の上にゲルをセットします。

セミドライブロティング基本操作④

 

 

 

ゲルの上にブロッティング溶液を染み込ませたろ紙をセットします。

ろ紙の上から、ブロッティングローラーを転がせ、過剰なブロッティング溶液を取り除き、密着させます。

セミドライブロティング基本操作⑤

 

 

 

 

 

通電し、ブロッティングを開始します。

操作説明動画も、せひご覧ください!

  

 

関連製品
型式 製品名 取扱説明書 SDS 各種コンテンツ
WSE-7055

電気泳動バッファー、タンク式ブロッティングバッファー

EzRun TG

 

 

 

ブロッティング試薬・消耗品

AE-1460

セミドライ式ブロッティングバッファー

EzBlot

AE-1465

セミドライ式高速ブロッティングバッファー

EzFastBlot

WSE-7210

セミドライ式高分子用高速ブロッティングバッファー

EzFastBlot HMW

AE-1340

CBB染色溶液

EzStain AQua

製品カタログ

簡単!失敗なし!トランスファーパック『QBlot kit』

QBlot kit

 

QBlot kit_前準備不要

  

  

『QBlot kit』は、セミドライブロッティング溶液で調製済みのPVDF膜とパットをセットでパックしたトランスファーパックです。1回分のパックの封を切り、電気泳動後のゲルをのせればすぐにブロッティングが可能です。通常、ウエスタンブロッティングのろ紙やメンブレンは、ブロッティングバッファーになじませる平衡化作業が必須です。これには15~30分程度の時間を要します。QBlot kitなら面倒な平衡化は必要なく、封を切ればすぐにウエスタンブロッティングに使用可能です。専用ブロッティングバッファーにより転写効率も高く、短時間で高効率のウエスタンブロッティングが可能です。また専用の給水パットを使用しているため、転写ムラや気泡ぬけの失敗も少なく、どなたでも簡単に使用することができます。

QBlot kit_転写ムラ気泡抜け例

  

  

参考データ

QBlot kit_参考データ

上図は 10ng/ レーン~ 1/4 希釈したヒト血漿タンパク質を電気泳動し、QBlot kit とEzFastBlot を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示しています。

転写したブロッティング膜を 1/50,000 希釈したヒトアルブミン抗体と反応させ、EzWestLumi plus でバンドを検出しました。

QBlot kit は EzFastBlot の半分の転写時間の 5 分で、同等の検出が可能です。また 10 分の転写時間では、より高感度な検出が可能になりました。

  

  

QBlot kit 使用方法

実験材料

実験ステップ  
試薬調製
QBlot 使用方法_Buffer準備

 

  

  

 

Gel Wash Buffer を蒸留水で 5 倍希釈し、1× Gel Wash Buffer を調製します。

QBlot kit 使用方法
QBlot 使用方法_open

 

 

  

  

  

QBlot kit の Bottom Stackを取り出します。

QBlot 使用方法_Bottom

 

 

  

Bottom Stackをホライズブロットの陽極板の上にセットします。

QBlot 使用方法_ゲル

 

  

  

電気泳動後のゲルを、1× Gel Wash Buffer で軽くすすぎ、Bottom Stack の上にセットします。

QBlot 使用方法_Top

 

  

  

Top Stack をゲルの上に積層します。

QBlot 使用方法_ローラー

 

 

 

  

ブロッティングローラーで気泡をぬき、しっかり密着させます。

ホライズブロット

   

  

  

ホライズブロットの上部電極板をセットします。

ホライズブロット+Ghibli

  

リード線を接続し、パワーステーションギブリⅠとつなげます。以下の表を参考に条件を設定し、ブロッティングを開始します。

通電条件_QBlot kit

*旧型のホライズブロットWSE-4020/4040については、Top Stackの上に、ろ紙(CB-09A)を1枚追加します。

 

★ 操作説明動画もご覧ください!

 

  

関連製品
型式 製品名 取扱説明書 SDS 各種コンテンツ
WSE-1150

PAGE スラブ電気泳動装置

PageRunAce

   

「高速ハイレゾ電気泳動」カタログ

WSE-4115

電源付きセミドライブロッティング装置

PoweredBlotAce

   

 ブロッティング装置

手のひらサイズの実験装置!コンパクトシリーズのご紹介

WSE-4025

セミドライ式ブロッティング装置

HorizeBlot 2M

   

 ブロッティング装置

WSE-3100

電源装置

PowerStation GhibliⅠ

   

電源装置シリーズ

WSE-7120

高感度HRP用発光基質

EzWestLumi Plus

ウエスタンブロッティングHRP用高感度発光基質

WSE-6300

超高感度化学発光撮影装置

LuminoGraphⅢ

   

高分子タンパク質を高速転写するなら!『EzFastBlot HMW』

EzFastBlot HMW

 

EzFastBlot-HMW-HMW_medium

  

『EzFastBlot HMW』は、200kDa 以上の高分子量タンパク質を、高速ブロッティングできるセミドライブロッティング試薬です。

使いやすい1液系で、メタノールを使用しない組成のため、廃液処理に手間もかかりません。

  

  

参考データ

EzFastBlotHMW_参考データ

上図は EzFastBlot HMW と自作の転写バッファー(100mM Tris / 192mM Glycine / 10% MeOH)を用いてブロッティングを行った後のブロッティング膜を染色した結果です。
自作転写バッファーに比べてEzFastBlot HMWでは240kDa 以上の高分子側バンドが濃く転写されていることが確認できました。このようにセミドライ式でもタンク式と同等の転写効率の高さが確認できました。

  

  

EzFastBlot HMW 使用方法

実験材料

実験ステップ  
試薬調製
EzFastBlot HMW_溶液調製

 

  

  

 

EzFastBlot HMW を蒸留水で 5 倍希釈し、ワーキング溶液(ブロッティングバッファー)を調製します。

膜の親水化・平衡化
PVDF膜 平衡化

 

 

  

  

  

PVDF膜の親水化、平衡化を行います。

  • 親水化:PVDF膜より一回り大きい容器に数mLのメタノールを入れます。そこにPVDF膜を入れて約10秒間浸漬します。
  • 平衡化:別の容器に、ブロッティングバッファーを約50mL 準備し、メタノールから引き上げた膜を入れて、5~15分間振とうします。はじめは膜が浮きやすいので注意し、PVDF膜を完全に溶液中に浸すよう振とうします。
ブロッティング
EzFastBlotHMW_積層方法

 

 

  

ろ紙より一回り大きい容器を用意し、ブロッティング バッファーを約 50mL 入れ、CB-09A(ろ紙)を 6枚浸漬します。

※他社ろ紙を用いる場合は、ゲルと同じサイズに切断し、合計で約 6mm 厚以上となる枚数を準備します。

  

左図のように、ろ紙、PVDF膜、ゲルを積層します。

IMG_8879__

 

  

ブロッティングバッファーに浸漬した 3枚のろ紙を、ホライズブロットの陽極板の上にセットします。

その上に、親水、平衡化済みのPVDF膜をセットします。

QBlot 使用方法_ゲル

 

 

 

電気泳動後のゲルをブロッティングバッファーで軽くすすぎ (数分以内)、PVDF膜の上にセットします。

QBlot 使用方法_ローラー

   

  

  

ブロッティングバッファーに浸漬した 3枚のろ紙を、ホライズブロットの陽極板の上にセットします。

ブロッティングローラーで気泡をぬき、しっかり密着させます。

ホライズブロット

  

  

  

ホライズブロットの上部電極板をセットします。

ホライズブロット+Ghibli

  

  

リード線を接続し、パワーステーションギブリⅠとつなげます。以下の表を参考に条件を設定し、ブロッティングを開始します。

通電条件_EzFastBlotHMW

  

 

関連製品
型式 製品名 取扱説明書 SDS 各種コンテンツ
WSC-2400

振とう器

シーソーシェーカーatto

   

カタログ

WSE-4050~4054

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・Pプラス膜シリーズ

 

ブロッティング試薬・消耗品

WSE-4060~4064

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・P膜(低蛍光)シリーズ

 

Total Proteinによるノーマライズ

ブロッティング試薬・消耗品

短時間で転写を終わらせたい!高速転写するなら『EzFastBlot』

EzFastBlot_medium

『EzFastBlot』は、セミドライブロッティング時間を大幅に短縮可能な高速ブロッティング試薬です。

使いやすい1液系で、メタノールを使用しない組成のため、廃液処理に手間がかかりません。

  

  

参考データ

EzFastBlot_参考データ

上図は125ng/レーン~1/2希釈したヒト血漿タンパク質を電気泳動し、EzFastBlot と、自作の転写バッファー(100mM Tris / 192mM Glycine / 10% MeOH)を用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示しています。

転写したブロッティング膜を 1/4,000 希釈したヒトトランスフェリン抗体および 1/10,000 希釈したHRP標識2次抗体と反応させ、EzWestLumi plusでバンドを検出しました。

EzFastBlot は自作の転写バッファーに比べ、短時間で高効率の転写が可能であることが確認できました。

  

  

EzFastBlot 使用方法

実験材料

実験ステップ  
試薬調製
EzFastBlot_溶液調製

 

  

  

 

EzFastBlot HMW を蒸留水で 5 倍希釈し、ワーキング溶液(ブロッティングバッファー)を調製します。

膜の親水化・平衡化
PVDF膜 平衡化

 

 

  

  

  

PVDF膜の親水化、平衡化を行います。

  • 親水化:PVDF膜より一回り大きい容器に数mLのメタノールを入れます。そこにPVDF膜を入れて約10秒間浸漬します。
  • 平衡化:別の容器に、ブロッティングバッファーを約50mL 準備し、メタノールから引き上げた膜を入れて、5~15分間振とうします。はじめは膜が浮きやすいので注意し、PVDF膜を完全に溶液中に浸すよう振とうします。
ブロッティング
EzFastBlot_積層方法

 

 

  

ろ紙より一回り大きい容器を用意し、ブロッティング バッファーを約 50mL 入れ、CB-09A(ろ紙)を 4枚浸漬します。

※他社ろ紙を用いる場合は、ゲルと同じサイズに切断し、合計で約 4mm 厚以上となる枚数を準備します。

※お使いのブロッティング装置により、ろ紙の枚数が異なります。取扱説明書をご覧ください。

左図のように、ろ紙、PVDF膜、ゲルを積層します。

IMG_8879__

 

  

ブロッティングバッファーに浸漬した 2枚のろ紙を、ホライズブロットの陽極板の上にセットします。

その上に、親水、平衡化済みのPVDF膜をセットします。

QBlot 使用方法_ゲル

 

 

 

電気泳動後のゲルをブロッティングバッファーで軽くすすぎ (数分以内)、PVDF膜の上にセットします。

QBlot 使用方法_ローラー

   

  

  

ブロッティングバッファーに浸漬した 2枚のろ紙を、ホライズブロットの陽極板の上にセットします。

ブロッティングローラーで気泡をぬき、しっかり密着させます。

ホライズブロット

  

  

  

ホライズブロットの上部電極板をセットします。

ホライズブロット+Ghibli

  

  

リード線を接続し、パワーステーションギブリⅠとつなげます。以下の表を参考に条件を設定し、ブロッティングを開始します。

通電条件_EzFastBlot

  

  

関連製品
型式 製品名 取扱説明書 SDS 各種コンテンツ
WSC-2400

振とう器

シーソーシェーカーatto

   

製品カタログ

WSE-4050~4054

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・Pプラス膜シリーズ

 

ブロッティング試薬・消耗品

WSE-4060~4064

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・P膜(低蛍光)シリーズ

 

Total Proteinによるノーマライズ

ブロッティング試薬・消耗品

WSE-7120

高感度HRP用発光基質

EzWestLumi Plus

ウエスタンブロッティングHRP用高感度発光基質

WSE-6300

超高感度化学発光撮影装置

LuminoGraphⅢ

   
 

より高い効率を求めるなら!『EzBlot』

EzBlot

『EzBlot』は、3溶液系のブロッティング試薬で、効率の高い転写が可能なブロッティング試薬です。

低分子から高分子に至るまで、効率の高い転写が可能です。

不連続系のバッファー組成のため、一般的に転写されにくいと言われる塩基性タンパク質や複合タンパク質も、効率よく転写することができます。

  

  

参考データ

EzBlot_参考データ

上図は分子量マーカーとタンパク質を電気泳動し、EzBlot を用いてセミドライブロッティングした膜とタンク式ブロッティングをした膜を染色した結果です。枠で囲んだ部分の分子量マーカー EzProtein Ladder が、低分子から高分子に至るまですべてのバンドが抜けることなく転写できていることがわかります。このようにセミドライ式でもタンク式と同等の転写効率の高さが確認できました。

  

  

EzBlot 使用方法

実験材料

実験ステップ  
試薬調製
EzBlot_溶液調製

 

  

  

 

使用時に ブロッティングバッファー A、B、C液のボトル1本に対してメタノールを25mLずつ添加します。

メタノール添加後はラベルのチェックボックスにチェックを入れ、冷蔵保存してください。

メタノールを添加すると1×ワーキング溶液(ブロッティングバッファー)となりますので、そのままご使用ください。

膜の親水化・平衡化
PVDF膜 平衡化

 

 

  

  

  

PVDF膜の親水化、平衡化を行います。

  • 親水化:PVDF膜より一回り大きい容器に数mLのメタノールを入れます。そこにPVDF膜を入れて約10秒間浸漬します。
  • 平衡化:別の容器に、ブロッティングバッファー B液を約50mL 準備し、メタノールから引き上げた膜を入れて、5~15分間振とうします。はじめは膜が浮きやすいので注意し、PVDF膜を完全に溶液中に浸すよう振とうします。
ブロッティング
EzBlot_積層方法

 

 

付属のディスポーザブルトレイを2枚用意し、ブロッティングバッファー A、C液を各50mLずつ入れます。各トレイにろ紙を浸漬します。

ろ紙の枚数は以下の通りに浸漬してください。

  • ブロッティングバッファー A液:2枚
  • ブロッティングバッファー B液:1枚(PVDF膜と同じトレイに浸漬します)
  • ブロッティングバッファー C液:3枚

左図のように、ろ紙、PVDF膜、ゲルを積層します。

IMG_8879__

 

  

ブロッティングバッファー A液に浸漬した 2枚のろ紙を、ホライズブロットの陽極板の上にセットします。

その上に、ブロッティングバッファー B液に浸漬した 1枚のろ紙を、ろ紙の上にセットします。

ろ紙の上に、親水化、ブロッティングバッファー B液で平衡化済みのPVDF膜を、ろ紙の上にセットします。

QBlot 使用方法_ゲル

 

 

 

電気泳動後のゲルをブロッティングバッファーで軽くすすぎ (数分以内)、PVDF膜の上にセットします。

QBlot 使用方法_ローラー

   

  

  

ブロッティングバッファー C液に浸漬した 3枚のろ紙を、ゲルの上にセットします。

ブロッティングローラーで気泡をぬき、しっかり密着させます。

ホライズブロット

  

  

  

ホライズブロットの上部電極板をセットします。

ホライズブロット+Ghibli

  

  

  

リード線を接続し、パワーステーションギブリⅠとつなげます。2mA/cm2で30~60分間に設定し、ブロッティングを開始します。

 

関連製品
型式 製品名 取扱説明書 SDS 各種コンテンツ
wSE-1150

PAGE スラブ電気泳動装置

PageRunAce

   

「高速ハイレゾ電気泳動」カタログ

WSE-7020

分子量マーカー

EzProtein Ladder

 
WSC-2400

振とう器

シーソーシェーカーatto

   

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WSE-4050~4054

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・Pプラス膜シリーズ

 

ブロッティング試薬・消耗品

WSE-4060~4064

ブロッティング用PVDF膜

クリアブロット・P膜(低蛍光)シリーズ

 

Total Proteinによるノーマライズ

ブロッティング試薬・消耗品

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